Le dictionnaire anglais-français est autorisé.
L'usage de tout ouvrage de référence, de tout autre dictionnaire et de tout matériel électronique (y compris la calculatrice) est rigoureusement interdit.
Si vous repérez ce qui vous semble être une erreur d'énoncé, vous devez le signaler très lisiblement sur votre copie, en proposer la correction et poursuivre l'épreuve en conséquence. De même, si cela vous conduit à formuler une ou plusieurs hypothèses, vous devez la (ou les) mentionner explicitement.
NB : Conformément au principe d'anonymat, votre copie ne doit comporter aucun signe distinctif, tel que nom, signature, origine, etc. Si le travail qui vous est demandé consiste notamment en la rédaction d'un projet ou d'une note, vous devrez impérativement vous abstenir de la signer ou de l'identifier.
Les enzymes :
de la catalyse biologique à l'outil biotechnologique
Les enzymes jouent un rôle central dans le fonctionnement des systèmes biologiques car elles accélèrent efficacement et de manière très spécifique les réactions chimiques qui s'y déroulent. Ces biocatalyseurs sont également à l'origine d'applications biotechnologiques sophistiquées, parfois associées à des enjeux économiques très importants.
Première partie :
À l'aide du dossier documentaire et de l'analyse de résultats expérimentaux fournis, dégager les caractéristiques que doivent présenter les enzymes pour constituer des outils exploitables en biotechnologie, les limites liées à leur nature biologique, ainsi que quelques stratégies utilisées pour permettre leur amélioration.
Présenter ensuite les adaptations qui permettent d'en faciliter le transfert technologique, pour une utilisation aussi bien dans le domaine de la production en bio-industries que dans celui de l'analyse.
Seconde partie :
En s'appuyant sur le dossier documentaire fourni, et dans la perspective d'un enseignement en BTS Biotechnologies, proposer une démarche pédagogique sur le thème de la catalyse enzymatique et de ses applications biotechnologiques, permettant de répondre à des objectifs de formation choisis parmi ceux présentés dans le document 10.
Liste des documents du dossier technique :
Document 1 : L'importance des enzymes en biotechnologie
Document 2 : Approche multidisciplinaire utilisée pour l'optimisation de processus biocatalytiques
Document 3 : Comparaison des caractéristiques cinétiques de mutants de l'HydroxyButyryl-CoA Déshydrogénase de Clostridium butyricum (CbHBD)
Document 4 : Caractérisation d'une protéase purifiée à partir d'une souche de Bacillus cereus
Document 5 : Différentes stratégies d'amélioration des propriétés d'une enzyme par génie génétique en fonction des informations disponibles la concernant
Document 6 : Création de novo d'une enzyme par modélisation bioinformatique de site actif
Document 7 : Étude de l'immobilisation de la phosphatase alcaline sur nanoparticules de chitosane par pontages covalents et caractérisation de l'enzyme immobilisée
Document 8 : Utilisation d'enzymes immobilisées en réacteur enzymatique pour la clarification et la fluidification d'un jus de fruits
Document 9 : Les biocapteurs à acétylcholinestérase appliqués à la détection et au dosage des composés organophosphorés
Document 10 : Extraits du référentiel du BTS Biotechnologies
INFORMATION AUX CANDIDATS
Vous trouverez ci-après les codes nécessaires vous permettant de compléter les rubriques figurant en en-tête de votre copie.
Ces codes doivent être reportés sur chacune des copies que vous remettrez.
Concours externe du CAPET de l'enseignement public :
Document 1 : L'importance des enzymes en biotechnologie
Bacillus amyloliquefaciens, B. subtilis, Aspergillus oryzae, Streptomyces spp.
Enzymatic hydrolysis of proteins
α-amylase
Various bacilli and Aspergillus oryzae
Hydrolysis of starch
β-amylase
Various bacilli, barley
Degradation of starch
Glucoamylase
Aspergillus niger, Rhizopus species
Starch hydrolyzed to glucose syrup.
Glucose isomerase
Various bacilli, Streptomyces spp.
Glucose isomerized to fructose
Invertase
Saccharomyces spp.
Sucrose hydrolyzed to glucose and fructose
Penicillin acylase
E. coli, various bacilli, Streptomyces spp.
Production of semisynthetic penicillins
Pectinases
Aspergillus niger
Enzymatic hydrolysis of pectin
Lipase
Candida antarctica
Hydrolysis of triglycerides
Derived from plants
Papain
Carica papaya
Meat tenderization
Bromelain
Pineapple fruit/stem
Chill proofing of beers
Actinidin
Kiwi fruit
Meat tenderization
Lipoxygenase
Soybean
Bread making and aroma production
Derived from animal sources
Chymosin (rennet)
Stomach of calves
Cheese manufacture
Ancrod
Snake venom
Anticoagulant
Urokinase
Urine
Thrombolytic
Trypsin
Animal pancreas
Digestive aid
Pancreatin (amylase, protease, lipase)
Pancreatic extract
Digestive aid
Pepsin
Stomach of animals
Digestive aid
Acetyl-cholinesterase
Bovine erythrocytes
Analysis of organophosphorus compounds such as pesticides
Cholesterol esterase
Porcine pancreas
Detect serum cholesterol levels
Source : Young Je Yoo, Yan Feng, Yong-Hwan Kim - Fundamentals of Enzyme Engineering (2017, Springer Netherlands)
Document 2 : Approche multidisciplinaire utilisée pour l'optimisation de processus biocatalytiques
Source : Chapman et coll. 2018. Catalysts. 8, 238
Document 3 : Comparaison des caractéristiques cinétiques de mutants de l'HydroxyButyryl-CoA Déshydrogénase de Clostridium butyricum (CbHBD)
Le n-butanol présente un intérêt dans différents secteurs : biocarburants, cosmétiques, pharmaceutiques. Les rendements de production de n-butanol par fermentation microbienne sont limités, du fait de la production concurrente d'acétone et d'éthanol par les bactéries et de la toxicité de ces solvants pour celles-ci. Une alternative à la culture consiste à reconstituer in vitro une voie de synthèse artificielle associant les enzymes nécessaires à la production du n-butanol. La 3-HydroxyButyryl-CoA Déshydrogénase (HBD) est l'une des enzymes impliquées dans cette synthèse. Elle catalyse la réaction suivante :
La structure de l'enzyme étant connue, les caractéristiques cinétiques de l'enzyme native (Wild-type) et de trois mutants produits par génie génétique (L232Y, K50A/K54A et K50A/K54A/L232Y) sont comparées.
3-A : Représentation partielle du site actif de la CbHBD
Lys 50, Lys 54, Asn 141, Leu 232, Asn 221 : acides aminés potentiellement impliqués dans le positionnement et la stabilisation du substrat
3-B : Courbes de Lineweaver et Burk obtenues pour l'enzyme native et les trois mutants
3-C : Paramètres cinétiques calculés pour l'enzyme native et les trois mutants
CbHBD Protein
K_m (mM)
vmax (mM/min)
kcat (min^(− 1))
kcat/Km (mM^(− 1) min^(− 1))
kcat/km (fold) ^a
Wild type
0.028
56.81
3.4 × 10^3
1.2 × 10^5
1
L232Y
0.022
72.46
4.5 × 10^3
2.0 × 10^5
1.7
K50A/K54A
0.027
69.44
8.3 × 10^3
3.0 × 10^5
2.5
K50A/K54A/L232Y
0.016
79.36
9.5 × 10^3
5.9 × 10^5
4.9
Document 4 : Caractérisation d'une protéase purifiée à partir d'une souche de Bacillus cereus
Les protéases sont des enzymes utilisées en industrie chimique pour la fabrication de lessives, ainsi que dans les industries alimentaires et pharmaceutiques. Une protéase isolée de Bacillus cereus a été étudiée en vue de son transfert dans un processus industriel. Dans ce but, les effets de la température, du pH et de plusieurs molécules à différentes concentrations sur l'activité de l'enzyme, ont été évalués.
Document 5 : Différentes stratégies d'amélioration des propriétés d'une enzyme par génie génétique, en fonction des informations disponibles la concernant
Source : Bornscheuer U.T. and Pohl M., 2001. Current Opinion in Chemical Biology. 5 (2): 137-143
Document 6 : Création de novo d'une enzyme par modélisation bioinformatique de site actif
Le cycle Benzisoxazole est un motif rencontré dans plusieurs actifs pharmacologiques (antipsychotiques et anticonvulsifs). L'ouverture de ce cycle (élimination de Kemp), catalysée chimiquement par une base, passe par un unique intermédiaire réactionnel. Celui-ci est instable, du fait de la création d'une charge négative partielle sur l'oxygène* du cycle isoxazole lors du retrait d'un proton sur le carbone attaqué par la base (#). Cet intermédiaire peut être stabilisé par des interactions hydrophobes d'empilement entre son cycle plan et un autre cycle aromatique, entraînant la dispersion de la charge négative créée. Une stabilisation supplémentaire peut être obtenue par interaction entre l'atome d'oxygène ^∗ du cycle isoxazole et un groupement donneur de liaison hydrogène. Il n'existe pas d'enzyme naturelle connue catalysant cette réaction.
Création de novo d'une enzyme catalysant l'élimination de Kemp : exemple de structure de site actif théorique d'une « Kemp Éliminase » créée par bioinformatique (« Théozyme ») et résultat du positionnement des acides aminés de ce Théozyme, dans une protéine échafaudage receveuse. Les caractéristiques de l'enzyme ont été évaluées après expression chez E. coli de la protéine échafaudage dans laquelle les acides aminés catalytiques ont été introduits par mutagenèse dirigée.
Document 7 : Étude de l'immobilisation de la phosphatase alcaline sur nanoparticules de chitosane par pontages covalents et caractérisation de l'enzyme immobilisée
7-A : Évaluation de l'efficacité de fixation de la phosphatase alcaline sur les nanoparticules de chitosane
Total enzyme
Immobilized enzyme
Total protein
Retained protein
Binding efficiency ^b
U^a(1000U/mg)
%
U(546U/mg)
%
mg
%
mg
%
1000 ± 11.8
100
546 ± 9.3
54.6%
1.0±0.4
100
0.762 ± 0.06
76.23%
0.71
Average ± standard deviation ( n = 5 ) ^a U means the enzyme unit ^b Binding efficiency calculated as the percentage of U(54.6%) / percentage of retained protein (76.23%).
7-B : Mesure des paramètres cinétiques des formes libre et immobilisée la phosphatase alcaline (ALP) en utilisant le para-nitrophénylphosphate comme substrat
Parameters
Free ALP
Immobilized ALP
K_m and K_(m.app)(molL^(− 1))
0.21±0.05
0.38±0.06
V_(max) and V_(max. app)(molL^(− 1) min^(− 1))
0.60 ± 0.04
0.87±0.08
7-C : Activités de l'ALP libre et de sa forme immobilisée en fonction de la température et du pH
7-D : Activité résiduelle de l'ALP immobilisée après plusieurs cycles successifs de réutilisations
Document 8 : Utilisation d'enzymes immobilisées en réacteur enzymatique pour la clarification et la fluidification d'un jus de fruits
Le jus obtenu par pressage des fruits est un liquide trouble et visqueux du fait de colloïdes liés à la présence de pectines. Ces polyosides, naturellement présents dans le fruit, doivent être hydrolysés afin de fluidifier et de clarifier celui-ci. Cette hydrolyse peut être réalisée par un mélange d'enzymes pectinolytiques immobilisées sur support solide et utilisées dans divers types de réacteurs enzymatiques. Les paramètres de fonctionnement de chaque type de réacteur utilisé doivent alors être eux-mêmes optimisés pour améliorer le processus.
8-A : Exemples de réacteurs enzymatiques expérimentaux utilisés pour traiter le jus de fruit brut
8-B : Temps de traitement complet de 50 mL d'un jus en fonction du débit pour le réacteur à lit fixe
8-C : Comparaison des temps de traitement d'un jus (50 mL) selon le type de réacteur
Document 9 : Les biocapteurs à acétylcholinestérase appliqués à la détection et au dosage des composés organophosphorés
Les organophosphorés sont des composés neurotoxiques entrant dans la composition d'insecticides (exemples : Malathion, Chlorpyriphos-éthyl, Méthidathion) et de gaz de combat (exemples : Sarin, Tabun). Leur présence dans l'environnement peut être détectée à l'aide de biocapteurs à acétylcholinestérase immobilisée, enzyme dont ils inhibent l'activité en se fixant sur son site actif.
9-A : Structure d'un biocapteur à Acétylcholinestérase
AchE = acétylcholinestérase fixée sur l'électrode de travail
WE = Électrode de travail
RE = Électrode de référence (Ag/AgCl)
CE = Contre-électrode
9-C : Réponse d'un biocapteur à acétylcholinestérase pour trois pesticides organophosphorés
Document 10 : Extraits du référentiel du BTS Biotechnologies
ANNEXE Ib : SAVOIRS ET SAVOIR-FAIRE
Les savoirs associés technologiques, professionnels et généraux sont organisés en 10 modules :
Module 1 : Biologie moléculaire et génie génétique
Module 2 : Biochimie analytique
Module 3 : Biochimie structurale et fonctionnelle des protéines
Module 4 : Microbiologie et génie fermentaire
Module 5 : Biologie et technologies cellulaires
Module 6 : Bio-informatique et informatique de laboratoire
Module 7 : Qualité, Santé et sécurité au travail
Module 8 : Mathématiques et sciences physiques
Module 9 : Anglais
Module 10 : Expression française
Module 3 : Biochimie structurale et fonctionnelle des protéines
-Première année : 1 heure de cours hebdomadaire
-Deuxième année : 2 heures de cours + 3,5 heures de travaux pratiques hebdomadaires
Module 3 section 5 : Les enzymes, biomolécules catalytiques
INTITULE DU PROGRAMME
COMMENTAIRES
COURS
TP
5-1- Structure et classification des enzymes
Spécificité de la catalyse enzymatique
X
Classification internationale des enzymes
- Principe - Choix de quelques exemples (kinases, deshydrogénases ...) dans des classes et des métabolismes différents pour illustrer les rôles in vivo des enzymes
X
Isoenzymes
X
Complexes multienzymatiques
A l'aide d'un exemple comme le système « pyruvate déshydrogénase ».
X
5-2- L'activité enzymatique
Grandeurs et unités d'enzyme
x
Les différentes méthodes et techniques de mesure
-Techniques absorptiométriques, (pHmétriques, fluorimétriques, ...) de détermination
-Méthodes par prélèvements, en deux points et en cinétiques
X
X
5-3- Cinétique enzymatique Michaélienne
Détermination des constantes cinétiques d'une enzyme
x
X
5-4- Effecteurs physicochimiques
Température, pH
Effets de la température et du pH
X
X
Effecteurs michaeliens (inhibiteurs) Composition du milieu réactionnel (force ionique, cations, conservateurs)
Caractérisation d'un inhibiteur compétitif
X
X
5-5- Exemples de mécanismes d'action des enzymes ; exemples de coenzymes
-Ribonucléase pancréatique ou alpha chymotrypsine ; aminotrasférases ; lysozyme ; endonucléases de restriction.... A partir de l'analyse de documents ; les méthodes d'étude seront évoquées.
-Les deux catégories de co-enzymes ; exemples : ATP, NAD, FAD, PLP ...
X
Module 3 section 6 : Les enzymes, outils d'analyse et de bioconversion
6-3- L'immobilisation des enzymes
Méthodes d'immobilisation
-Immobilisations d'enzymes par méthodes physiques et chimiques
-Caractérisation et étude d'une enzyme immobilisée
x
X
Propriétés des enzymes immobilisées
-Détermination d'un rendement d'immobilisation
-Mise en évidence de limitations diffusionnelles, de thermostabilisation..
X
X
6-4- Les biocapteurs
Principe et technologies
Exemple d'un biocapteur enzymatique Généralisation
Illustration d'un biocapteur enzymatique (à glucose par exemple)
x
X
Exemples d'applications
x
6-5- Les bioréacteurs enzymatiques
Différents types, mise en œuvre et modélisation
Réalisation et mise en oeuvre d'un bioréacteur simple
x
X
Exemples d'applications
x
Le recyclage des cofacteurs
X
^a The values of the CbHBD mutants were calculated based on the kcat/Km value of the CbHBD wild type as 1. Source : d'après Kim Eun-Jung et coll., 2014. J. Microbiol. Biotechnol., 24(12), 1636-1643.
Même année, AgrégationAgrégation biologie externe 2020, épreuve 1Agrégation · 2020Sujet seul
Même année, CAPLPCAPLP biologie externe 2020, épreuve 1, option santé-environnementCAPLP · 2020Sujet seul
