Corrigé détaillé ENS Physique BCPST 2023 (page 3/4 : Partie II (questions 25 à 44))

Le principe de la formation des images est le suivant :

• Les molécules fluorescentes émettant aux longueurs d'onde \lambda_1 et \lambda_2 sont situées au foyer objet F_{\text{obj}} de l'objectif. Par conséquent, les rayons émergeant de l'objectif forment un faisceau collimaté parallèle à l'axe optique de l'objectif.

• Ce faisceau arrive en incidence normale sur le réseau de diffraction. À la traversée du réseau, l'ordre 1 est diffracté sous un angle \theta_k tel que \sin\theta_k = \lambda_k/a. Comme \lambda_2 > \lambda_1, l'angle de diffraction vérifie :

  \theta_2 > \theta_1
• L'axe optique de la lentille tube étant aligné avec la direction de diffraction à \lambda_1 (\theta = \theta_1), le faisceau de longueur d'onde \lambda_1 entre parallèlement à son axe optique et converge au foyer image F'_t, formant l'image ponctuelle I_1 au centre du détecteur.
• Le faisceau à \lambda_2 forme un angle \theta_2 - \theta_1 > 0 avec l'axe optique de la lentille tube. Il converge donc en un point image I_2 situé dans le plan focal image de la lentille tube, séparé spatialement de I_1 sur la surface sensible de la caméra.

Le réseau comporte n = 500\text{ traits}\cdot\text{mm}^{-1} = 5{,}00 \times 10^5\text{ m}^{-1}. Le pas du réseau a vaut donc :

D'après la formule des réseaux donnée par l'équation (5), pour un faisceau incident en incidence normale et diffracté à l'ordre k = 1, l'angle de diffraction \theta vérifie :

Les angles de diffraction \theta_1 et \theta_2 associés respectivement à \lambda_1 et \lambda_2 s'écrivent :

La différence angulaire s'exprime donc rigoureusement par :

Comme l'écart \Delta\lambda = \lambda_2 - \lambda_1 = 40\text{ nm} est petit devant les longueurs d'onde considérées, on peut également différencier la relation des réseaux à a fixé :

Application numérique :

D'où la différence angulaire :

Avec deux chiffres significatifs :

D'après l'énoncé, la lentille de tube est orientée de façon à ce que le faisceau diffracté à l'ordre 1 pour \lambda_1 soit parallèle à son axe optique. Il converge donc en son foyer image F'_t, centre de la première tache.

Le faisceau diffracté à la longueur d'onde \lambda_2 fait un angle \Delta\theta = \theta_2 - \theta_1 avec l'axe optique de la lentille de tube. Ce faisceau collimaté converge dans le plan focal image de la lentille de tube à une distance d de l'axe optique donnée, dans les conditions de Gauss (\Delta\theta \ll 1), par :

Avec f'_t = 200\text{ mm} et la valeur obtenue à la question Q26 (\Delta\theta \approx 2{,}1 \times 10^{-2}\text{ rad}) :

Calculons à présent la taille de la surface sensible de la caméra. Le capteur est formé de 2000 \times 2000 pixels carrés de côté c = 5\,\mu\text{m}. Le côté L du capteur vaut :

La surface sensible est donc un carré de 10\text{ mm} \times 10\text{ mm}.

La distance entre les deux taches (d \approx 4{,}2\text{ mm}) est du même ordre de grandeur que la taille du capteur : elle représente environ 42\,\% du côté du détecteur (d < L). Les deux taches peuvent donc être observées simultanément sur le capteur, à condition de centrer convenablement l'image sur la caméra.

D'après le rappel de l'énoncé, la tache de diffraction associée à une molécule ponctuelle possède sur le capteur un rayon :

Les molécules émettent à \lambda_1 = 550\text{ nm} et \lambda_2 = 590\text{ nm}, soit une longueur d'onde moyenne \lambda \approx 570\text{ nm} = 0{,}57\,\mu\text{m}.

Avec g_m = 100 et \mathrm{ON} = 1{,}5, on obtient pour le rayon de la tache :

(ou plus précisément r_1 \approx 18\,\mu\text{m} pour \lambda_1 et r_2 \approx 20\,\mu\text{m} pour \lambda_2).

Le diamètre de la tache de diffraction vaut ainsi :

Chaque pixel étant un carré de côté p = 5\,\mu\text{m}, le nombre de pixels correspondant est :

• en rayon :

  N_r = \frac{r}{p} = \frac{19\,\mu\text{m}}{5\,\mu\text{m}} \approx 3{,}8 \approx 4\text{ pixels}

• en diamètre (taille totale de l'image) :

  N_D = \frac{D}{p} = \frac{38\,\mu\text{m}}{5\,\mu\text{m}} \approx 7{,}6 \approx 8\text{ pixels}

Chaque molécule fluorescente donne sur le capteur une tache circulaire de rayon :

Pour que les deux taches ne se chevauchent pas (ne se superposent pas), la distance d entre leurs centres doit être au moins égale à la somme de leurs rayons :

Comme \lambda_1 \approx \lambda_2 \approx \lambda, les deux rayons sont très proches (r_1 \approx r_2 \approx r), de sorte que la distance minimale correspond au diamètre 2r d'une tache :

Application numérique : Avec g_m = 100, \mathrm{ON} = 1{,}5, \lambda_1 = 550\text{ nm} et \lambda_2 = 590\text{ nm} :

soit :

En termes de pixels (avec un pixel de côté p = 5\,\mu\text{m} d'après l'énoncé) :

D'après la question 28, chaque tache de diffraction a un diamètre :

Pour que les deux images soient non superposées et séparées d'un pixel (p = 5\,\mu\mathrm{m}) entre leurs bords, la distance requise entre leurs centres doit être :

Or, le réseau de 500\text{ fentes}\cdot\mathrm{mm}^{-1} induit d'après la question 27 un écartement entre centres de :

La distance réelle est près de cent fois supérieure à la valeur visée : la dispersion introduite par ce réseau est beaucoup trop importante.

Considérons un dioptre plan séparant deux milieux d'indices respectifs n_1 et n_2. Un rayon lumineux incident se propageant dans le milieu d'indice n_1 rencontre la surface de séparation au point d'incidence I.

On définit le plan d'incidence comme le plan contenant le rayon incident et la normale au dioptre au point I. Les angles géométriques i_1, i'_1 et i_2 sont mesurés par rapport à cette normale.

Les trois lois de Snell-Descartes s'énoncent ainsi :

1. Loi de coplanarité : les rayons réfléchi et réfracté sont situés dans le plan d'incidence. De part et d'autre de la surface séparatrice, ils se trouvent du côté opposé au rayon incident par rapport à la normale.

2. Loi de la réflexion : l'angle de réflexion i'_1 est égal à l'angle d'incidence i_1 :

   \boxed{i'_1 = i_1}

3. Loi de la réfraction : l'angle de réfraction i_2 et l'angle d'incidence i_1 vérifient la relation :

   \boxed{n_1 \sin(i_1) = n_2 \sin(i_2)}

1. Schéma du prisme et tracé des rayons

2. Réfraction sur la face d'entrée

Le faisceau incident est normal à la face d'entrée plane du prisme, ce qui correspond à un angle d'incidence i_1 = 0. D'après la loi de Snell-Descartes :

Le faisceau n'est donc pas dévié et pénètre dans le prisme en se propageant en ligne droite le long de l'horizontale.

3. Réfraction sur la face de sortie

Dans le triangle formé par le sommet S, le point d'entrée et le point d'émergence I :

• l'angle au sommet vaut B ;
• le rayon étant perpendiculaire à la face d'entrée, il fait avec la face de sortie un angle égal à \frac{\pi}{2} - B.

La normale à la face de sortie étant orthogonale à cette face, l'angle d'incidence i_2 du faisceau sur le dioptre de sortie vérifie :

En appliquant la loi de Snell-Descartes pour la réfraction au dioptre verre-air (d'indices respectifs n et n_{\text{air}} = 1) :

soit :

D'après la relation établie à la question précédente :

Dans le cas d'un prisme cale (ou prisme de faible angle au sommet), l'angle B est très petit devant 1\text{ rad} (B \ll 1). On peut alors effectuer un développement limité au premier ordre de la fonction sinus :

L'indice optique du verre étant de l'ordre de n \approx 1{,}5, la quantité n \sin B \approx n B reste très petite devant 1. Par conséquent, l'angle émergent r est également très petit (r \ll 1\text{ rad}), ce qui permet d'écrire :

La relation se simplifie donc sous la forme linéaire :

où les angles r et B sont impérativement exprimés en radians (ou dans la même unité angulaire).

D'après la loi de Cauchy donnée dans l'énoncé :

La fonction \lambda \mapsto n(\lambda) est strictement décroissante sur le domaine visible (dispersion normale). Puisque \lambda_1 < \lambda_2, on a :

D'après la relation établie à la question Q32, l'angle d'émergence r sur la face de sortie vérifie :

La fonction sinus étant strictement croissante sur [0, \frac{\pi}{2}], il vient :

L'angle de déviation total du prisme sous incidence normale étant D = r - B, le rayon de longueur d'onde \lambda_1 est donc plus dévié vers la base du prisme que le rayon de longueur d'onde \lambda_2 :

Description des tracés à apporter au schéma :

• À l'intérieur du prisme : le faisceau arrive sous incidence normale sur la face d'entrée (i=0). Les deux composantes \lambda_1 et \lambda_2 pénètrent sans être déviées (r=0) et se propagent de manière superposée selon l'horizontale jusqu'à la face de sortie.
• Sur la face de sortie : la normale est inclinée d'un angle B par rapport à la direction de propagation interne. Les deux rayons subissent une réfraction vers le bas (vers la base du prisme, s'éloignant de la normale).
• À l'extérieur du prisme : le rayon correspondant à \lambda_1 (plus courte longueur d'onde) émerge en faisant un angle r_1 avec la normale plus grand que l'angle r_2 du rayon à \lambda_2. Le rayon à \lambda_1 est donc situé en dessous du rayon à \lambda_2.

D'après la question Q33, pour un prisme cale (B \ll 1), l'angle d'émergence sous incidence normale s'écrit au premier ordre :

En convertissant l'angle B en radians :

Calculons les angles de sortie pour chacune des deux longueurs d'onde :

• Pour \lambda_1 = 550\text{ nm}, avec n_1 = 1{,}627 :

  \begin{aligned} r_1 &= 1{,}627 \times 3{,}00^\circ = 4{,}881^\circ \approx 4{,}88^\circ \\ r_1 &\approx 1{,}627 \times 5{,}236 \times 10^{-2}\text{ rad} = 8{,}52 \times 10^{-2}\text{ rad} \end{aligned}

• Pour \lambda_2 = 590\text{ nm}, avec n_2 = 1{,}623 :

  \begin{aligned} r_2 &= 1{,}623 \times 3{,}00^\circ = 4{,}869^\circ \approx 4{,}87^\circ \\ r_2 &\approx 1{,}623 \times 5{,}236 \times 10^{-2}\text{ rad} = 8{,}50 \times 10^{-2}\text{ rad} \end{aligned}

La différence entre les angles de sortie vaut :

Numériquement, avec n_1 - n_2 = 1{,}627 - 1{,}623 = 0{,}004 :

avec r_1 = 4{,}88^\circ = 8{,}52 \times 10^{-2}\text{ rad} et r_2 = 4{,}87^\circ = 8{,}50 \times 10^{-2}\text{ rad}.

Les molécules fluorescentes étant situées dans le plan focal objet de l'objectif, la lumière émise en ressort sous la forme d'un faisceau parallèle (collimaté).

Après traversée du prisme, les faisceaux émergents associés aux longueurs d'onde \lambda_1 et \lambda_2 restent parallèles entre eux au sein de chaque faisceau, mais forment une déviation angulaire mutuelle \Delta r établie à la question précédente :

L'axe optique de la lentille de tube étant aligné avec le faisceau de longueur d'onde \lambda_1, celui-ci converge exactement au foyer image F'_t sur le capteur de la caméra.

Le faisceau de longueur d'onde \lambda_2 aborde la lentille de tube sous l'angle d'incidence \Delta r par rapport à son axe optique. Dans le cadre de l'approximation de Gauss (\Delta r \ll 1\text{ rad}), les rayons convergent dans le plan focal image à une distance \Delta x de l'axe optique donnée par :

Application numérique : Avec f'_t = 200\text{ mm} = 0{,}200\text{ m} et \Delta r \approx 2{,}09 \times 10^{-4}\text{ rad} (obtenu à la question Q35 avec B = 3^\circ = \frac{\pi}{60}\text{ rad} et n_1 - n_2 = 0{,}004) :

D'après la question Q28, le diamètre de la tache de diffraction associée à chaque molécule vaut :

Pour que deux images soient non superposées et que leurs bords soient séparés d'un pixel (p = 5\,\mu\text{m}), la distance entre leurs centres doit valoir :

Or, le prisme cale introduit un écart entre les centres des deux taches (question Q36) de :

L'espace entre les bords des deux taches est alors :

Contrairement au réseau de diffraction qui produisait une dispersion excessive (d \approx 4{,}2\text{ mm} = 840\text{ pixels}, question Q27), ce dispositif à prisme sépare les deux longueurs d'onde au plus juste, maximisant ainsi le champ de vue utile sur le capteur tout en évitant les risques de chevauchement avec d'autres molécules environnantes.

Examinons la répartition de l'énergie pour chacun des deux éléments dispersifs :

• Le réseau de diffraction en transmission répartit le flux incident d'une longueur d'onde donnée entre de multiples directions correspondant aux différents ordres de diffraction k \in \mathbb{Z} (k = 0, \pm 1, \pm 2, \dots). Une part importante de l'énergie est transmise dans l'ordre 0 (non dispersé) ainsi que dans les ordres supérieurs. Comme seule la lumière diffractée dans l'ordre k = 1 est dirigée vers la lentille de tube et collectée par la caméra, tous les photons diffractés dans les autres ordres sont perdus pour la détection.
• Le prisme, quant à lui, fonctionne par réfraction à travers deux dioptres plans. Pour chaque longueur d'onde incidente, il ne produit qu'un unique faisceau réfracté émergeant du prisme (aux pertes par réflexion vitreuse près, qui peuvent être rendues minimes par un traitement antireflet).

Par conséquent, la quasi-totalité de l'énergie lumineuse émise par la molécule à une longueur d'onde donnée est dirigée vers le capteur dans le cas du prisme, tandis qu'une fraction seulement est collectée avec le réseau.

1. Image d'une molécule placée en A (confondue avec F_{\text{obj}})

Le point objet A étant situé au foyer objet F_{\mathrm{obj}} de l'objectif, l'image intermédiaire donnée par l'objectif est rejetée à l'infini : les rayons issus de A émergent de l'objectif sous la forme d'un faisceau collimaté, parallèle à l'axe optique.

La lentille de tube, de centre O_t et de distance focale image f'_t, reçoit ce faisceau parallèle à l'axe optique et le focalise dans son plan focal image. L'image définitive A' est donc confondue avec le foyer image de la lentille de tube :

Elle se forme précisément sur la surface sensible de la caméra (qui est positionnée dans le plan focal image de la lentille de tube).

2. Position de l'image d'une molécule placée en A_1

Le point objet A_1 est situé entre le foyer objet F_{\mathrm{obj}} et le centre optique de l'objectif O_{\mathrm{obj}}, c'est-à-dire :

L'objectif n'est pas assez convergent pour faire converger ou collimater les rayons issus de A_1 : ceux-ci émergent sous la forme d'un faisceau divergent. L'image intermédiaire A'_{1,\mathrm{inter}} est donc virtuelle et située très en amont de l'objectif (à gauche de F_{\mathrm{obj}}) :

Cette image intermédiaire constitue un objet réel pour la lentille de tube, situé à une distance algébrique finie \overline{O_t A'_{1,\mathrm{inter}}} < 0 telle que |\overline{O_t A'_{1,\mathrm{inter}}}| > f'_t.

D'après la relation de conjugaison de Descartes appliquée à la lentille de tube :

Comme \overline{O_t A'_{1,\mathrm{inter}}} < 0, on a :

L'image finale A'_1 se forme donc en aval du foyer image F'_t :

3. Schéma optique

1. Effet sur la caméra des molécules situées hors du plan focal objet

Le plan du capteur de la caméra coïncide avec le plan focal image de la lentille de tube (plan contenant F'_t).

• Une molécule située hors du plan focal objet de l'objectif (comme le point A_1 de la question précédente) ne donne pas une image ponctuelle sur le détecteur : son plan de conjugaison se situe en aval (si l'objet est entre F_{\mathrm{obj}} et l'objectif) ou en amont (si l'objet est au-delà de F_{\mathrm{obj}}) du plan du capteur.
• Sur la surface sensible de la caméra, le faisceau lumineux issu d'une telle molécule forme donc une tache floue étalée (tache de défocalisation).
• L'ensemble des molécules excitées réparties dans l'épaisseur de l'échantillon superpose ainsi une multitude de larges taches lumineuses, créant un halo continu de lumière parasite ou bruit de fond de fluorescence.

2. Conséquence sur le signal issu d'une molécule fluorescente située en F_{\mathrm{obj}}

La molécule située en F_{\mathrm{obj}} forme quant à elle une tache de diffraction nette et localisée sur quelques pixels. Toutefois :

• Une molécule unique n'émet qu'un flux limité de photons (\phi_{\mathrm{fl},\max} \sim 10^8\text{ photons}\cdot\mathrm{s}^{-1} au maximum).
• Ce signal utile se retrouve superposé à l'important fond lumineux continu généré par toutes les molécules hors foyer.
• Les fluctuations statistiques de ce fond (bruit de grenaille) diminuent considérablement le rapport signal sur bruit (\mathrm{RSB}) et le contraste de l'image.

En conséquence, le signal de la molécule individuelle risque d'être totalement noyé dans le bruit de fond, rendant sa détection impossible en microscopie d'épifluorescence classique.

D'après la loi de Snell-Descartes pour la réfraction au dioptre plan séparant les milieux d'indices respectifs n_1 et n_2 :

ce qui conduit à :

Un rayon réfracté ne peut exister que si \sin\theta_2 \le 1, ce qui impose :

Le milieu incident étant plus réfringent que le milieu émergent (n_1 > n_2), on a \dfrac{n_2}{n_1} < 1. Il existe donc un angle d'incidence particulier \theta_{\lim} \in \left[0, \frac{\pi}{2}\right], appelé angle limite de réfraction, tel que :

Pour tout angle d'incidence strictement supérieur (\theta_1 > \theta_{\lim}), l'équation de Snell-Descartes n'admet aucune solution réelle pour \theta_2 : aucun rayon n'est transmis dans le milieu 2, l'onde incidente est intégralement réfléchie dans le milieu 1. C'est le phénomène de réflexion totale.

Application numérique : D'après les données fournies :

Par lecture sur la figure 1 (courbe de la fonction \arcsin pour x = 0{,}88), on relève :

Le milieu entre l'objectif et la lamelle est homogène d'indice n_1 grâce à l'huile d'immersion. L'interface entre la lamelle et la solution aqueuse (d'indice n_2) est perpendiculaire à l'axe optique de l'objectif. Ainsi, l'angle d'incidence \theta_1 d'un rayon lumineux sur cette interface est égal à l'angle que fait ce rayon avec l'axe optique.

D'après la question Q41, pour obtenir une réflexion totale à l'interface lamelle/solution, l'angle d'incidence doit vérifier :

Par définition, l'angle maximal \theta_{\max} qu'un rayon peut faire avec l'axe optique est limité par l'ouverture numérique de l'objectif :

Pour qu'un faisceau puisse subir la réflexion totale en sortie de l'objectif, il faut que l'objectif autorise des rayons d'angle \theta_{\max} \geqslant \theta_{\lim}, ce qui se traduit par :

L'ouverture numérique minimale recherchée s'écrit donc :

Par définition de l'ouverture numérique d'un objectif fonctionnant dans un milieu d'indice n_1 :

où \theta_{\max} désigne l'angle maximal que peut faire un rayon lumineux émergeant de l'objectif avec son axe optique.

On en déduit l'expression du sinus de cet angle maximal :

D'après les valeurs numériques fournies par l'énoncé :

À l'aide de la courbe représentative de la fonction \arcsin donnée en figure 1, pour une abscisse x = 0{,}99, on lit :

1. Tracé des rayons entrant dans l'objectif

Le faisceau laser émerge de l'objectif sous la forme d'un faisceau collimaté (rayons parallèles entre eux), incliné d'un angle \theta par rapport à l'axe optique.

• Pour le sens de propagation de la lumière (du bas vers le haut), le plan focal situé en amont de l'objectif est le plan focal contenant F'_{\mathrm{obj}} (appelé couramment plan focal arrière ou back focal plane).
• Des rayons émergeant parallèles d'une lentille convergente proviennent d'un même point source S situé dans ce plan focal amont.
• Le rayon passant par le centre optique O de l'objectif n'étant pas dévié, le point source S se situe à l'intersection de la droite support de ce rayon central avec le plan focal contenant F'_{\mathrm{obj}}.
• Les rayons entrant dans l'objectif sont donc des rayons divergents issus de ce point S.

2. Positionnement de la lentille en amont

Le faisceau laser incident étant initialement collimaté (parallèle) :

• Il faut placer une lentille convergente en amont de telle sorte que son foyer image soit situé dans le plan focal arrière de l'objectif (le plan contenant F'_{\mathrm{obj}}).

• Pour obtenir un faisceau émergent incliné d'un angle \theta (avec \theta > \theta_{\lim} afin d'assurer la réflexion totale), ce point de focalisation S doit être décentré latéralement d'une distance d par rapport à l'axe optique :

  d = f'_{\mathrm{obj}} \tan\theta

  Il suffit pour cela de translater transversalement la lentille (ou le faisceau laser incident) perpendiculairement à l'axe optique, vers la périphérie de la pupille de l'objectif.