Corrigé détaillé Centrale Physique 2 PC 2021

Pour un œil standard (emmétrope), une observation sans fatigue, dite « sans accommodation », s'effectue lorsque le système optique renvoie l'image finale à l'infini (au punctum remotum de l'œil).

L'image intermédiaire A_1B_1, conjuguée de l'objet AB par l'objectif, joue le rôle d'objet pour l'oculaire. Pour qu'une lentille mince donne d'un objet une image située à l'infini, cet objet doit être placé dans son plan focal objet.

L'image intermédiaire donnée par l'objectif doit donc se former dans le plan focal objet de l'oculaire (le point A_1 étant situé au foyer principal objet F_2 de l'oculaire) :

L'objet AB est placé perpendiculairement à l'axe optique, en avant du foyer principal objet F_1 de l'objectif L_1.

1. Construction de l'image intermédiaire A_1B_1 par l'objectif L_1 : Pour déterminer la position du point image B_1, on trace deux rayons issus de B :

• le rayon passant par le centre optique O_1, qui n'est pas dévié ;
• le rayon parallèle à l'axe optique, qui émerge de L_1 en passant par le foyer principal image F'_1.

Ces deux rayons se coupent en B_1. Le point A_1 étant le projeté orthogonal de B_1 sur l'axe optique, il est confondu avec le foyer principal objet de l'oculaire :

L'image intermédiaire A_1B_1 est réelle, inversée et fortement agrandie.

2. Construction de l'image définitive à travers l'oculaire L_2 : Le point B_1 appartenant au plan focal objet de L_2, l'oculaire en donne une image à l'infini :

• les deux rayons précédemment tracés se propagent au-delà de B_1 et rencontrent la lentille L_2 ;
• ils émergent de L_2 parallèlement entre eux, inclinés d'un angle \alpha' par rapport à l'axe optique, parallèlement au rayon fictif non dévié passant par B_1 et le centre optique O_2.

L'image finale A'B' est donc rejetée à l'infini :

D'après la question Q1, pour une observation sans accommodation à travers l'oculaire, l'image intermédiaire A_1 donnée par l'objectif de l'objet A se forme dans le plan focal objet de l'oculaire :

La distance algébrique entre le foyer image de l'objectif F'_1 et cette image intermédiaire est donc égale à l'intervalle optique (ou longueur de tube) \Delta :

D'après la relation de Newton pour le grandissement transversal \gamma rappelée dans le formulaire de l'énoncé :

Comme \overline{F'_1 O_1} = -f'_1, il vient :

Application numérique : avec \Delta = 160\text{ mm} et \gamma = -40{,}0,

L'objectif forme de l'objet A une image intermédiaire A_1 avec un grandissement algébrique :

En utilisant la relation de conjugaison de Descartes avec origine au centre pour la lentille convergente modélisant l'objectif :

On en déduit la position algébrique de l'objet :

La distance entre le centre optique et l'objet vaut donc :

D'après la figure 1, le plan de front P est situé entre le centre optique O_1 et l'échantillon A, d'où :

Application numérique : Avec f'_1 = 4{,}0\text{ mm}, \gamma = -40{,}0 et O_1P = 3{,}5\text{ mm} :

Rôle du système à ressort : La distance frontale w étant extrêmement faible (0{,}6\text{ mm} = 600\ \mu\text{m}), lors d'une mauvaise manipulation au cours de la mise au point (rapprochement trop important du tube ou de la platine), l'objectif risque d'entrer en collision avec la lamelle couvre-objet. Un système de monture rétractable à ressort amortit le contact en permettant à la lentille frontale de s'enfoncer, évitant ainsi de briser la lame de préparation et de rayer ou détruire définitivement la lentille frontale de l'objectif.

L'œil est positionné dans le plan focal image de l'oculaire (en F'_2). Il observe de façon nette :

• Sans accommoder (vision au punctum remotum, PR = \infty) : l'image finale est à l'infini, donc l'image intermédiaire A_1 se forme en F_2, soit \overline{F'_1 A_1} = \Delta.

• En accommodant au maximum (vision au punctum proximum, PP) : l'image finale A' se forme à la distance minimale de vision distincte d_m = 25\text{ cm} en avant de l'œil, soit :

  \overline{F'_2 A'} = -d_m = -250\text{ mm}

Déterminons la position de l'image intermédiaire A_{1,\text{prox}} correspondante à l'aide de la relation de conjugaison de Newton pour l'oculaire L_2 :

L'intervalle de déplacement de l'image intermédiaire est donc :

Par la relation de Newton pour l'objectif L_1 :

Comme \delta A_1 \ll \Delta = 160\text{ mm}, on peut utiliser l'approximation différentielle :

La latitude de mise au point \delta \ell s'exprime ainsi par :

Application numérique :

La latitude de mise au point étant extrêmement faible (de l'ordre du micromètre), le tube du microscope doit impérativement être équipé d'une vis micrométrique (commande de mise au point fine), en plus de la vis macrométrique.

Le point B est situé dans le plan objet de l'échantillon, orthogonal à l'axe optique en A. Par stigmatisme et aplanétisme approchés de la lentille mince L_1, l'image B' se forme dans le plan image conjugué, c'est-à-dire dans le plan du photodétecteur passant par le point image A' de A.

Comme le grandissement transversal est négatif (\gamma = -40 < 0), l'image B' est située sous l'axe optique (y_{B'} < 0 pour y_B > 0).

• Le rayon issu de B passant par le centre optique O_1 n'est pas dévié : son intersection avec le plan du détecteur donne la position exacte de B'.
• Le faisceau utile émis par B est limité par l'ouverture de la lentille L_1. Les rayons incidents issus de B qui rencontrent les bords supérieur et inférieur de la lentille L_1 sont déviés par la lentille et émergent en convergeant au point B'.

Le faisceau converge ainsi en un point B' situé hors de l'axe optique, dans le plan focal image intermédiaire, en dehors de la zone centrale où se trouve le trou d'entrée du photodétecteur.

Le plan du détecteur est positionné dans le plan image intermédiaire du microscope, c'est-à-dire dans le plan conjugué du plan de l'échantillon contenant A. Notons A' le point image de A sur l'axe optique, situé au centre du trou du photodétecteur.

Sur la figure C, le point C est situé sur l'axe optique, en amont du plan de l'échantillon (|\overline{O_1 C}| > |\overline{O_1 A}|, soit \overline{O_1 C} < \overline{O_1 A} < 0). D'après la relation de conjugaison de Descartes avec origine au centre :

Comme \overline{O_1 C} < \overline{O_1 A} < 0, on a :

L'image C' se forme donc sur l'axe optique en avant du plan du détecteur (entre le foyer image F'_1 et le plan du détecteur).

Pour tracer le faisceau lumineux issu de C :

• On trace les rayons incidents issus de C atteignant les bords supérieur et inférieur de la lentille L_1.
• Après réfraction par L_1, ces rayons convergent vers le point image C' situé sur l'axe optique en avant du détecteur.
• Au-delà de C', les rayons poursuivent leur propagation en ligne droite et divergent. Ils atteignent le plan du photodétecteur sous forme d'une tache largement étalée.

L'introduction d'un diaphragme de petite taille (ou trou de sténopé, pinhole) dans le plan du photodétecteur a pour fonction d'assurer un filtrage spatial tridimensionnel :

• Dans le plan de l'échantillon (sélection latérale) : les points situés hors de l'axe optique, comme le point B étudié à la question Q6, forment leur image conjuguée en dehors de l'axe optique. Le diaphragme bloque ainsi leurs faisceaux et isole uniquement la lumière issue du point A conjugué du trou ;
• Selon la profondeur (sélection axiale) : les points situés hors du plan focal objet, comme le point C étudié à la question Q7, forment une tache lumineuse défocalisée et étendue au niveau du plan du capteur. La quasi-totalité de leur flux lumineux est donc interceptée par les bords du diaphragme.

Ce diaphragme permet ainsi d'éliminer la lumière parasite et la fluorescence hors foyer (issues du solvant ou d'autres fluorophores), assurant le sectionnement optique de l'échantillon et améliorant de façon décisive le contraste et le rapport signal sur bruit.

Comme établi aux questions précédentes (Q6 à Q8), l'association du diaphragme de filtrage et du photodétecteur constitue un détecteur quasi-ponctuel : la lumière de fluorescence n'est collectée efficacement que si elle provient d'une région microscopique unique centrée sur l'axe optique dans le plan de mise au point (le point A).

Le microscope confocal n'effectue donc à chaque instant qu'une mesure ponctuelle du signal lumineux. Pour obtenir une image bidimensionnelle de l'échantillon, il est indispensable de faire correspondre à chaque point (ou pixel) du plan d'observation une mesure d'intensité.

D'après la relation de Planck-Einstein, l'énergie d'un photon absorbé ou émis est reliée à sa longueur d'onde dans le vide par :

Le schéma énergétique de la figure 4 montre que :

• l'absorption d'un photon laser de longueur d'onde \lambda = 532\text{ nm} fournit une énergie d'excitation \Delta E_{\text{exc}} = \frac{hc}{\lambda} qui porte la molécule dans un état vibrationnel élevé du niveau électronique excité ;
• une désexcitation non radiative (relaxation vibrationnelle) dissipe une partie de cette énergie sous forme thermique vers l'état vibrationnel le plus bas du niveau excité ;

• la désexcitation radiative (fluorescence) correspond à une transition d'énergie \Delta E_{\text{fluo}} strictement inférieure à l'énergie d'excitation :

  \Delta E_{\text{fluo}} < \Delta E_{\text{exc}}

L'énergie étant inversement proportionnelle à la longueur d'onde, on en déduit :

soit :

Le signal de fluorescence est donc émis à une longueur d'onde supérieure à celle du laser excitateur (décalage vers le rouge).

Le miroir dichroïque (ou lame semi-réfléchissante sélective en longueur d'onde) assure une double fonction :

1. Séparation géométrique des voies d'excitation et de détection : il réfléchit le faisceau laser incident (\lambda = 532\text{ nm}) vers l'objectif et l'échantillon, tout en transmettant la lumière de fluorescence issue de l'échantillon vers le photodétecteur.
2. Filtrage spectral de la lumière parasite : l'échantillon diffuse élastiquement une fraction de la lumière laser incidente (diffusion Rayleigh à \lambda = 532\text{ nm}), avec une intensité considérablement plus élevée que le signal de fluorescence. En réfléchissant la longueur d'onde d'excitation \lambda, le miroir empêche cette lumière laser diffusée d'atteindre le photodétecteur, évitant ainsi la saturation de celui-ci et préservant le rapport signal sur bruit.

D'après la question Q10, la lumière de fluorescence possède une longueur d'onde strictement supérieure à celle du laser :

Le miroir dichroïque doit donc se comporter comme un filtre passe-haut en longueur d'onde (ou « passe-long ») :

• À la longueur d'onde du laser, le miroir est réfléchissant :

  T(\lambda = 532\text{ nm}) \approx 0 \quad (\text{soit } R \approx 1)

• Pour les longueurs d'onde de fluorescence \lambda > \lambda_c (avec \lambda_c \gtrsim 532\text{ nm}), le miroir doit transmettre au maximum :

  T(\lambda) \approx 1

Le niveau 2 est peuplé par la transition 1 \to 2 à la vitesse k_e P_1 et dépeuplé par :

• la désexcitation radiative vers le niveau 1 à la vitesse k_r P_2,
• la désexcitation non radiative vers le niveau 1 à la vitesse k_{nr} P_2,
• le passage vers l'état triplet 3 (« inter-system crossing ») à la vitesse k_{isc} P_2.

Le bilan de probabilité pour le niveau 2 s'écrit donc :

Examinons la somme des dérivées temporelles des trois probabilités :

La somme des trois membres de droite étant identiquement nulle quel que soit le triplet (P_1, P_2, P_3), la relation :

montre que les trois équations différentielles ne sont pas linéairement indépendantes.

Puisque le système est fermé et que les seuls états accessibles à la molécule sont les niveaux 1, 2 et 3, ces trois états constituent un ensemble exhaustif (système complet d'événements).

Par conservation de la probabilité totale (condition de normalisation), la somme des probabilités d'occupation de ces niveaux vaut 1 à chaque instant :

L'image confocale est construite par balayage ligne par ligne (de haut en bas, ou de gauche à droite) de l'échantillon sous le faisceau laser. Une molécule fluorescente individuelle apparaît donc sous la forme d'une tache lumineuse (profil d'intensité) explorée séquentiellement au cours du temps.

Sur l'image b de la figure 3, à gauche de la molécule centrale entourée par le carré blanc, on observe une tache de fluorescence brutalement tronquée selon une ligne de balayage horizontale (demi-tache) :

• la molécule commence à fluorescer normalement lors du passage du faisceau sur les premières lignes de balayage ;
• au milieu de l'acquisition de la tache, la molécule subit une réaction photochimique destructive irréversible (photoblanchiment ou photobleaching) et cesse définitivement d'émettre ;
• pour les lignes suivantes de balayage, le signal retombe instantanément au niveau du bruit de fond.

En régime stationnaire, les probabilités d'occupation P_1, P_2 et P_3 sont constantes au cours du temps, si bien que :

Notons P_{1s}, P_{2s} et P_{3s} les probabilités stationnaires respectives.

L'équation différentielle régissant l'évolution du niveau triplet 3 donne :

Le système étant fermé (résultat de la question Q13), la somme des probabilités vaut 1 à tout instant :

En y injectant l'expression de P_{3s}, on obtient :

soit, en introduisant le paramètre K = 1 + \dfrac{k_{isc}}{k_T} :

D'après l'équation régissant l'évolution du niveau excité 2 établie à la question Q12, le régime stationnaire impose :

En remplaçant P_{1s} par son expression en fonction de P_{2s}, il vient :

On en déduit l'expression de la probabilité stationnaire d'occupation du niveau 2 :

D'après la question Q15, la probabilité stationnaire d'occupation du niveau excité 2 est donnée par :

Le taux de fluorescence en régime stationnaire s'écrit donc :

Lorsque le taux d'excitation devient très grand devant les taux de désexcitation (k_e \gg k_r, k_{nr}, k_{isc}), le premier terme du dénominateur devient négligeable devant K. Il en résulte l'existence d'une valeur limite :

Justification qualitative :

• Une molécule unique ne peut émettre qu'un photon à la fois et doit nécessairement passer par un cycle complet absorption-émission. Même si l'excitation 1 \to 2 est rendue quasi-instantanée par une forte intensité laser (k_e \to \infty, soit P_1 \to 0), la durée de désexcitation reste finie, limitée par le temps de séjour dans les états excités.
• Par ailleurs, à partir de l'état 2, la molécule a une probabilité non nulle de subir une conversion inter-système vers le niveau triplet 3 (taux k_{isc}). Ce niveau étant métastable (sa désexcitation radiative vers l'état fondamental est interdite de spin, d'où un taux k_T très faible), le fluorophore s'y retrouve piégé pendant une durée moyenne 1/k_T relativement longue. Ce phénomène de « goulot d'étranglement » plafonne la fraction de temps passée dans le niveau radiatif 2 à 1/K, limitant irrémédiablement le taux moyen d'émission à k_r/K.

Il n'est pas souhaitable d'exciter trop fortement l'échantillon pour plusieurs raisons majeures :

• Saturation du signal utile : d'après la question Q16, le taux de fluorescence sature à la valeur limite R_f^\infty. Augmenter la puissance d'excitation k_e au-delà de la saturation n'apporte donc aucun gain sur le signal de fluorescence S_f émis par la molécule.
• Dégradation du rapport signal sur bruit : le signal parasite de diffusion S_d issu du substrat est proportionnel à l'intensité laser I_0 sans effet de saturation (S_d \propto I_0, voir sous-partie I.F). Comme le signal utile S_f plafonne, le rapport signal sur fond S_f / S_d ainsi que le rapport signal sur bruit chutent à forte intensité.
• Accélération du photoblanchiment (photobleaching) : une molécule organique ne supporte qu'un nombre fini de cycles d'excitation avant d'être détruite de façon irréversible par réaction photochimique (perte de photostabilité évoquée avant Q14). Une excitation trop intense abrège dramatiquement sa durée de vie observable.
• Échauffement local : une forte densité de puissance lumineuse peut provoquer un échauffement local du substrat et dénaturer l'échantillon.

D'après le résultat établi à la question Q16, le taux limite de fluorescence s'exprime par :

Avec les valeurs numériques fournies par l'énoncé :

• K = 10 ;
• \tau_r = 5\text{ ns} = 5 \times 10^{-9}\text{ s}.

Le calcul donne immédiatement :

Ce taux d'émission correspond au nombre de photons émis par unité de temps :

D'après les questions Q15 et Q16, le taux de fluorescence en régime stationnaire et sa valeur limite s'écrivent :

Par définition, le taux d'excitation à saturation k_e^s vérifie la condition :

En injectant l'expression de R_f(k_e^s) :

D'où l'expression du taux d'excitation à saturation :

Cette grandeur s'écrit sous la forme demandée k_e^s = \frac{1}{\phi_f}\frac{k_r}{K} en introduisant le rendement quantique de fluorescence :

et on a bien :

En combinant cette relation avec l'expression R_f^\infty = \frac{k_r}{K}, on obtient immédiatement :

1. Dimension de \sigma

D'après les unités données dans l'énoncé :

• la constante d'Avogadro a pour dimension [N_A] = \mathrm{N}^{-1} (où \mathrm{N} désigne la dimension de la quantité de matière) ;

• le coefficient d'extinction molaire \varepsilon_{\max} est exprimé en \mathrm{mol}^{-1}\cdot\mathrm{L}\cdot\mathrm{cm}^{-1}, avec 1\text{ L} = 10^{-3}\text{ m}^3 et 1\text{ cm}^{-1} = 10^2\text{ m}^{-1}, d'où :

  [\varepsilon_{\max}] = \mathrm{N}^{-1}\cdot\mathrm{L}^3\cdot\mathrm{L}^{-1} = \mathrm{N}^{-1}\cdot\mathrm{L}^2

On en déduit immédiatement la dimension du rapport \sigma = \varepsilon_{\max} / N_A :

2. Sens concret de \sigma

La grandeur \sigma représente la section efficace d'absorption de la molécule individuelle. Concrètement, il s'agit de la surface fictive présentée par la molécule au flux de photons incidents : tout photon incident dont la trajectoire intercepte cette surface a une probabilité unitaire d'être absorbé par le fluorophore.

3. Calcul numérique et commentaire sur l'ordre de grandeur

Exprimons \varepsilon_{\max} en unités du Système International :

D'où la valeur de \sigma avec N_A = 6{,}02 \times 10^{23}\text{ mol}^{-1} :

Une dimension linéaire caractéristique associée à cette surface est :

Cet ordre de grandeur correspond aux distances interatomiques typiques dans une molécule organique (longueur d'une liaison chimique de l'ordre de 0{,}1 à 0{,}15\text{ nm}). La section efficace d'absorption est ainsi du même ordre de grandeur que la section géométrique de la molécule (ou du système conjugué responsable de l'absorption), ce qui confirme le caractère de « bon chromophore » du fluorophore.

D'après l'énoncé, l'intensité à saturation I_s et le taux d'excitation à saturation k_e^s sont reliés par :

où \sigma = \dfrac{\varepsilon_{\max}}{N_A} est la section efficace d'absorption définie à la question Q20.

D'après la question Q19, le taux d'excitation à saturation s'écrit :

On en déduit l'expression littérale de l'intensité à saturation :

Application numérique :

• Énergie d'un photon excitateur :

  h\nu = \frac{h c}{\lambda} = \frac{6{,}62 \times 10^{-34} \times 3{,}00 \times 10^8}{532 \times 10^{-9}} = 3{,}733 \times 10^{-19}\text{ J}

• Taux d'excitation à saturation :

  k_e^s = \frac{1}{1 \times 10 \times 5 \times 10^{-9}} = 2{,}0 \times 10^7\text{ s}^{-1}

• Section efficace d'absorption (en \text{cm}^2) :

  \varepsilon_{\max} = 1 \times 10^5\text{ mol}^{-1}\cdot\text{L}\cdot\text{cm}^{-1} = 1 \times 10^8\text{ mol}^{-1}\cdot\text{cm}^2
  \sigma = \frac{\varepsilon_{\max}}{N_A} = \frac{1{,}0 \times 10^8}{6{,}02 \times 10^{23}} = 1{,}66 \times 10^{-16}\text{ cm}^2

L'intensité à saturation vaut ainsi :

Commentaire : Bien qu'une intensité de plusieurs dizaines de kilowatts par centimètre carré paraisse considérable, la surface d'illumination au foyer d'un objectif de microscope est limitée par la diffraction à une tache d'aire S \sim \pi w_0^2 \sim 1\ \mu\text{m}^2 = 10^{-8}\text{ cm}^2.

Pour un laser hélium-néon de puissance usuelle P \sim 1\text{ mW}, l'intensité au point de focalisation atteint :

Cette valeur est supérieure à l'intensité de saturation I_s. Ainsi, même un laser de très faible puissance (1\text{ mW}) suffit largement à saturer l'absorption d'une molécule individuelle lorsqu'il est focalisé par un objectif de microscope.

Lors du balayage de l'échantillon dans le plan focal (z = 0), une molécule fluorescente quasi-ponctuelle sonde l'intensité du faisceau laser d'excitation. Le signal de fluorescence détecté est proportionnel à l'intensité locale I(r, 0) reçue par la molécule :

Le profil de coups détectés représenté sur la figure 3 correspond donc au profil gaussien d'intensité du faisceau laser au point de focalisation.

1. Évaluation de l'ouverture numérique :

Le maximum du profil atteint environ 250\text{ coups}. La demi-hauteur correspond à I \approx 125\text{ coups} (niveau repéré par la graduation 128). On lit sur l'axe des abscisses les positions pour lesquelles le signal vaut la moitié de son maximum :

La largeur à mi-hauteur (FWHM) vaut ainsi :

Pour un profil de la forme I(r) = I_0 \exp\left(-2 r^2/\omega_r^2\right), la largeur à mi-hauteur est reliée à \omega_r par :

On en déduit le rayon du col :

D'après la formule donnée dans le préambule de la sous-partie I.E, \omega_r = 0{,}5\,\frac{\lambda}{\sin\theta} = 0{,}5\,\frac{\lambda}{\mathrm{ON}}. L'ouverture numérique s'exprime donc par :

Avec \lambda = 532\text{ nm} = 0{,}532\ \mu\text{m} :

Compte tenu des incertitudes de lecture graphique sur la figure 3 :

(une valeur comprise entre 0{,}7 et 0{,}85 est tout à fait acceptable).

2. Intérêt d'une ouverture numérique élevée :

L'utilisation d'un objectif de grande ouverture numérique est primordiale pour deux raisons principales :

• Efficacité de collecte des photons : La fluorescence d'une molécule individuelle est émise de manière quasi-isotrope dans tout l'espace (4\pi\text{ sr}). L'objectif ne collecte la lumière que dans le cône d'angle au sommet 2\theta, correspondant à un angle solide \Omega = 2\pi(1-\cos\theta). Une valeur élevée de \mathrm{ON} = \sin\theta maximise l'angle solide de collecte, ce qui augmente directement l'efficacité de détection \eta_D et permet de capter un nombre suffisant de photons par molécule.
• Résolution spatiale et réjection du bruit de fond : La dimension de la tache focale \omega_r \propto 1/\mathrm{ON} diminue quand \mathrm{ON} augmente. D'une part, cela améliore la résolution spatiale (limite de diffraction) en évitant d'illuminer plusieurs fluorophores simultanément. D'autre part, cela réduit le volume focal excité V, limitant ainsi la diffusion parasite du substrat S_d \propto V et augmentant considérablement le rapport signal sur bruit.

Dans le plan focal (z = 0), le profil d'intensité transverse s'écrit :

La puissance totale P transportée par le faisceau s'obtient par intégration du flux du vecteur de Poynting à travers la section transverse :

Pour que le taux d'excitation atteigne le régime de saturation au centre de la tache focale, il faut que l'intensité crête soit de l'ordre de l'intensité à saturation, soit I_0 \sim I_s :

D'après la question Q22, pour \mathrm{ON} \approx 0{,}8 et \lambda = 532\text{ nm}, on a :

D'après la question Q21, l'intensité de saturation vaut I_s \approx 45\text{ kW}\cdot\text{cm}^{-2} = 4{,}5 \times 10^8\text{ W}\cdot\text{m}^{-2}.

Numériquement :

En ordre de grandeur :

La distribution spatiale de l'intensité lumineuse s'écrit :

L'intensité décroît rapidement dès que r > \omega_r ou |z| > \omega_z. La région dans laquelle l'intensité reste significative est un ellipsoïde de révolution d'axe Oz, de demi-petit axe \omega_r dans le plan transverse et de demi-grand axe \omega_z selon l'axe optique.

Son volume géométrique s'exprime par :

Remarque : La définition usuelle du volume effectif confocal V_{\text{eff}} = \iiint \frac{I(r,z)}{I_0}\,\mathrm{d}\tau = \left(\frac{\pi}{2}\right)^{3/2} \omega_r^2 \omega_z conduit au même ordre de grandeur (\sim \pi \omega_r^2 \omega_z).

D'après la question Q22, avec \lambda = 532\text{ nm} = 0{,}532\ \mu\text{m} et \mathrm{ON} = \sin\theta \approx 0{,}8 (soit \cos\theta = \sqrt{1 - 0{,}8^2} = 0{,}6) :

On en déduit l'ordre de grandeur du volume excité :

Sur l'image 3a, correspondant à une surface S = 25\ \mu\text{m} \times 25\ \mu\text{m} = 625\ \mu\text{m}^2, on observe quelques dizaines de taches de fluorescence bien séparées, soit environ N \approx 30 \text{ à } 60 molécules.

La densité surfacique de molécules dans le film est donc de l'ordre de :

Cela correspond à une distance moyenne intermoléculaire d \sim 1/\sqrt{\sigma_s} \approx 4\ \mu\text{m}, nettement supérieure à la dimension de la tache focale (2\omega_r \approx 0{,}7\ \mu\text{m}), condition indispensable pour pouvoir résoudre optiquement chaque molécule individuelle.

Le film mince ayant une épaisseur e = 100\text{ nm} = 10^{-7}\text{ m}, la densité volumique de fluorophores au sein de la matrice s'écrit :

En assimilant, en ordre de grandeur, cette densité à celle de la solution initiale de dépôt, la concentration molaire recherchée vaut :

Le taux de fluorescence R_f représente le nombre de photons émis par le fluorophore par unité de temps (en \text{photons}\cdot\text{s}^{-1}).

Pendant la durée d'acquisition \tau_a, le nombre total de photons émis par une molécule individuelle s'écrit :

L'efficacité globale de détection \eta_D correspond à la probabilité qu'un photon émis soit collecté par le système optique et converti en un « coup » par le photodétecteur. Le signal moyen de fluorescence détecté (en nombre de coups) est donc :

D'après les questions Q15, Q16 et Q19, le taux de fluorescence s'exprime en fonction de k_e et k_e^s par :

Pour k_e = 0{,}1\,k_e^s, on a :

Avec R_f^\infty = 2 \times 10^7\text{ photons}\cdot\text{s}^{-1} (question Q18) :

D'après la question Q26, le signal détecté par pixel au centre de la molécule s'écrit S_f = \eta_D R_f \tau_a. Sur le profil de comptage de la figure 3, le pic de fluorescence culmine à :

On en déduit la durée d'acquisition par pixel :

Avec \eta_D = 2\% = 0{,}02 (donnée du préambule de la partie I) :

L'image est constituée d'une grille de N_p = 256 \times 256 = 65\,536\text{ pixels}. Le temps de déplacement étant négligé, la durée totale nécessaire à l'acquisition de l'image b est :

(Une valeur comprise entre 7\text{ min} et 8\text{ min} est tout à fait acceptable selon la lecture de S_f et l'approximation éventuelle 1 + 0{,}1 \approx 1).

D'après l'énoncé, le signal total détecté est la somme du signal de fluorescence S_f et du signal de diffusion parasite S_d issu de la matrice :

Le bruit de comptage B, gouverné par la statistique poissonienne des photons détectés, s'écrit :

Le rapport signal sur bruit s'exprime donc par :

En utilisant l'expression du signal de fluorescence obtenue à la question Q26, S_f = \eta_D R_f \tau_a, et celle du signal parasite donnée par l'énoncé, S_d = \eta_D \sigma_d n V \dfrac{I_0 \tau_a}{h\nu}, il vient :

En mettant en facteur le terme commun \sqrt{\eta_D \tau_a}, on obtient finalement :

Le rapport signal sur bruit s'écrit, d'après le résultat de la question Q28 :

L'effet du diaphragme (trou confocal ou sténopé) se comprend par le filtrage spatial des rayons :

• Sur le signal de fluorescence S_f : la molécule imagée est située au point focal objet conjugué du diaphragme. L'objectif forme son image intermédiaire au centre de ce trou sténopé (dont la taille de 10\ \mu\text{m} est adaptée à celle de la tache de diffraction). Le faisceau de fluorescence passe donc intégralement à travers l'ouverture, si bien que S_f n'est pas atténué.
• Sur le bruit de fond de diffusion S_d : les molécules de la matrice situées en dehors du plan focal (en amont ou en aval selon l'axe optique, comme illustré à la question Q7) ou hors de l'axe (question Q6) convergent en dehors du diaphragme ou forment une tache très étalée sur son plan ; leur flux est ainsi presque totalement intercepté par les parois opaques du diaphragme.

L'insertion du trou réduit ainsi drastiquement le volume de collection V au seul volume confocal sub-femtolitre (V \sim 0{,}5\ \text{fL}, cf. question Q24). Par conséquent, le signal parasite S_d \propto V est fortement atténué, ce qui maximise le rapport signal sur bruit \dfrac{S_f}{B}.

À chaque étape de durée \tau, la particule effectue un saut de longueur a, soit vers la droite (abscisse x+a), soit vers la gauche (abscisse x-a). Les deux sens étant équiprobables par hypothèse, la probabilité de transition vers la droite ou vers la gauche vaut :

Pour se trouver en l'abscisse x_n à la date t_n, la particule devait nécessairement, à la date précédente t_{n-1} = t_n - \tau, se trouver en l'un des deux sites immédiatement voisins :

• soit en x_{n-1} = x_n - a, et faire un saut d'amplitude +a (probabilité 1/2) ;
• soit en x_{n+1} = x_n + a, et faire un saut d'amplitude -a (probabilité 1/2).

Ces deux événements étant mutuellement exclusifs, la formule des probabilités totales donne immédiatement :

La durée élémentaire d'un saut étant notée \tau, les dates discrètes vérifient la relation :

En supposant la fonction de probabilité continue p(x,t) de classe \mathcal{C}^1 par rapport à la variable temporelle t, on effectue un développement limité à l'ordre 1 en \tau à l'abscisse fixée x = x_n :

En négligeant les termes d'ordres supérieurs pour un pas de temps \tau infinitésimal à l'échelle mésoscopique, on obtient bien :

où la dérivée partielle est évaluée en (x_n, t_{n-1}).

En effectuant un développement limité à l'ordre 2 en puissances de a à l'instant t_{n-1}, il vient :

et de même pour le site voisin de gauche :

On obtient ainsi les deux relations demandées :

En sommant ces deux développements, les termes d'ordre 1 en a s'annulent par symétrie, ce qui donne la demi-somme intervenant dans l'équation maîtresse de la question Q30 :

D'après la relation de récurrence obtenue à la question Q30, on a :

En injectant l'approximation au premier ordre en temps de la question Q31 dans le membre de gauche et le résultat des développements spatiaux de la question Q32 dans le membre de droite, évalués au point (x_n, t_{n-1}), il vient :

En simplifiant par le terme p(x_n, t_{n-1}) commun aux deux membres, puis en divisant par \tau > 0, on obtient :

Cette égalité étant vérifiée en tout site x_n et à tout instant t_{n-1}, elle est valable pour les variables continues (x, t) :

La fonction p(x,t) vérifie donc bien une équation de diffusion unidimensionnelle, où le coefficient de diffusion s'écrit D = \dfrac{a^2}{2\tau}.

D'après les développements établis aux questions précédentes (questions Q30 à Q33), l'identification entre l'approximation temporelle au premier ordre et le développement spatial au second ordre conduit à :

Par identification avec l'équation de diffusion unidimensionnelle canonique :

on en déduit l'expression du coefficient de diffusion :

Soit \vec{u}_x le vecteur unitaire de l'axe (Ox). Initialement en O, la molécule effectue N sauts successifs indépendants. Notons \vec{\delta}_k le vecteur déplacement lors du k-ième saut (1 \leqslant k \leqslant N). La position de la molécule après N sauts s'écrit :

D'après l'énoncé, chaque saut est de longueur a et les deux sens de déplacement sont équiprobables :

La moyenne statistique du déplacement élémentaire vaut donc :

Par linéarité de la moyenne statistique, on en déduit :

Commentaire :

• En moyenne statistique, le barycentre d'un ensemble de particules diffusantes reste fixe à l'origine O : il n'y a aucun mouvement d'ensemble privilégié, c'est-à-dire aucune dérive (drift) ni transport convectif, du fait de la symétrie de la marche au hasard (absence de champ ou de force extérieure).
• Ce résultat moyen nul ne signifie nullement que la molécule reste immobile en O : elle s'éloigne effectivement de l'origine au cours du temps, mais explore symétriquement les deux sens de l'axe, ce que caractérise le moment d'ordre deux (déplacement quadratique moyen \langle \|\vec{OA_N}\|^2 \rangle \neq 0).

Le déplacement total après N sauts s'écrit sous forme de somme de pas élémentaires :

où, pour chaque pas k \in \{1, \dots, N\}, le saut s'effectue suivant l'axe (Ox) :

Le carré de la norme de ce déplacement s'écrit :

En prenant la moyenne statistique sur un grand nombre de réalisations et par linéarité de l'espérance :

• Pour les termes diagonaux :

  \|\vec{\delta_k}\|^2 = \delta_k^2 = (\pm a)^2 = a^2 \implies \langle \|\vec{\delta_k}\|^2 \rangle = a^2.

• Les sauts à des dates distinctes étant mutuellement indépendants, l'espérance du produit se factorise pour tout couple (j, k) avec j \neq k :

  \langle \vec{\delta_j} \cdot \vec{\delta_k} \rangle = \langle \vec{\delta_j} \rangle \cdot \langle \vec{\delta_k} \rangle = \vec{0} \cdot \vec{0} = 0.

On en déduit :

Chaque saut ayant une durée \tau, la durée totale associée à N sauts est \Delta t = N \tau, soit N = \frac{\Delta t}{\tau}. En utilisant l'expression du coefficient de diffusion D = \frac{a^2}{2\tau} obtenue à la question Q34 :

Le déplacement quadratique moyen est bien strictement proportionnel à la durée \Delta t.

D'après la question Q36, à une dimension d'espace, le déplacement quadratique moyen s'écrit :

L'énoncé précise qu'à deux dimensions d'espace, le coefficient de proportionnalité reliant \Delta^2 à \Delta t est multiplié par deux, ce qui conduit à :

La modélisation linéaire de l'évolution temporelle du déplacement quadratique moyen s'écrit \Delta^2 = \beta \Delta t, par identification :

Puisque le déplacement quadratique moyen s'exprime en \text{m}^2 et la durée en \text{s}, le coefficient directeur \beta ainsi que le coefficient de diffusion D ont pour unité du Système International le \text{m}^2\cdot\text{s}^{-1}.

Avec la valeur numérique \beta = 4 \times 10^{-13}\text{ m}^2\cdot\text{s}^{-1}, on obtient :

1. Nom de la grandeur \alpha :
   La grandeur \alpha est la polarisabilité (souvent qualifiée de volume de polarisabilité lorsqu'elle est définie en factorisant la permittivité diélectrique du vide \varepsilon_0) de l'entité microscopique.

2. Dimension de \alpha :
   Par définition, un moment dipolaire électrique s'écrit \vec{p} = q\,\vec{r}, sa dimension est donc :

   [p] = \mathrm{I}\cdot\mathrm{T}\cdot\mathrm{L} \quad (\text{en }\mathrm{C\cdot m})

   D'après le théorème de Gauss en électrostatique (\mathrm{div}\,\vec{E} = \rho/\varepsilon_0), le terme \varepsilon_0 \vec{E} a la dimension d'une charge par unité de surface (ou d'un déplacement électrique \vec{D}) :

   [\varepsilon_0 E] = \frac{[q]}{[\text{Surface}]} = \mathrm{I}\cdot\mathrm{T}\cdot\mathrm{L}^{-2} \quad (\text{en }\mathrm{C\cdot m^{-2}})

   En reliant ces deux grandeurs par \vec{p} = \alpha \varepsilon_0 \vec{E}, il vient :

   [\alpha] = \frac{[p]}{[\varepsilon_0 E]} = \frac{\mathrm{I}\cdot\mathrm{T}\cdot\mathrm{L}}{\mathrm{I}\cdot\mathrm{T}\cdot\mathrm{L}^{-2}} = \mathrm{L}^3

   La grandeur \alpha est donc homogène à un volume (elle s'exprime en \mathrm{m^3} dans le Système international) :

   \boxed{[\alpha] = \mathrm{L}^3}

3. Ordre de grandeur littéral :
   Pour une particule ou une molécule sphérique de rayon caractéristique a et de volume V \sim a^3, la polarisation induite par un champ électrique extérieur conduit à un dipôle proportionnel au volume de l'édifice électronique :

   \boxed{\alpha \sim a^3 \sim V}

   (Pour une sphère métallique conductrice de rayon a, l'électrostatique donne rigoureusement \alpha = 4\pi a^3).

D'après la question Q38, la polarisabilité d'une entité microscopique varie comme le cube de sa dimension caractéristique :

1. Ordres de grandeur des dimensions :

• Pour la nanoparticule métallique, le sujet indique une taille a_1 \sim 10\text{ nm} = 10^{-8}\text{ m} (ou un rayon de l'ordre de 5\text{ nm}).
• Pour une molécule organique (telle que le pérylène), la taille caractéristique est de l'ordre de a_2 \sim 0{,}5\text{ à }1\text{ nm} \sim 10^{-9}\text{ m}.

On en déduit l'ordre de grandeur du rapport des polarisabilités :

Selon l'estimation retenue pour le rayon de la nanoparticule (5 ou 10\text{ nm}) et la taille moléculaire, ce rapport est compris entre 10^{-4} et 10^{-3}. On retient :

2. Conclusion sur l'effet d'antenne : Sous l'action du champ électrique laser \vec{E}, le dipôle induit dans la nanoparticule \vec{p}_1 = \alpha_1 \varepsilon_0 \vec{E} est beaucoup plus intense que celui de la molécule isolée \vec{p}_2 = \alpha_2 \varepsilon_0 \vec{E} :

La nanoparticule métallique capte donc l'onde électromagnétique incidente avec une efficacité considérablement supérieure à celle de la molécule seule. Elle se comporte comme une antenne optique nanométrique : elle collecte l'énergie lumineuse, exalte fortement le champ électromagnétique local à son voisinage immédiat et rayonne une onde diffusée d'amplitude bien plus grande, ce qui amplifie considérablement le signal Raman de la molécule adsorbée.

Par définition du vecteur densité volumique de courant associé au déplacement d'une population de porteurs de charge identiques, on a :

où \rho_m est la densité volumique de charge mobile et \vec{v} la vitesse moyenne d'ensemble des porteurs.

Pour les électrons de conduction, de densité particulaire n et de charge électrique individuelle q = -e, la densité volumique de charge mobile s'écrit \rho_m = -n e.

En passant à la représentation complexe en régime sinusoïdal établi, le lien linéaire entre le courant et la vitesse se conserve :

Dans le référentiel du laboratoire supposé galiléen, on applique le principe fondamental de la dynamique à un électron de conduction (de masse m et de charge -e), en négligeant le poids et la force magnétique :

En régime sinusoïdal forcé à la pulsation \omega, avec la convention \mathrm{e}^{\mathrm{i}\omega t}, la dérivation temporelle se traduit par une multiplication par \mathrm{i}\omega :

D'où l'expression de la vitesse complexe de l'électron :

D'après la question Q40, le vecteur densité volumique de courant s'écrit \underline{\vec{\jmath}_e} = -n e\,\underline{\vec{v}}, soit :

Par identification avec la loi d'Ohm locale en régime harmonique \underline{\vec{\jmath}_e} = \underline{\sigma}\,\underline{\vec{E}}, on obtient la conductivité électrique complexe :

En utilisant la pulsation plasma \omega_p = \sqrt{\dfrac{n e^2}{m\varepsilon_0}}, c'est-à-dire \dfrac{n e^2}{m} = \varepsilon_0 \omega_p^2, on obtient finalement :

D'après la question Q41, la conductivité électrique complexe s'écrit :

Dire que \tau est « suffisamment grand » signifie que le temps moyen entre deux collisions dissipatives est très grand devant la période de l'onde lumineuse, soit :

En négligeant 1 devant \mathrm{i}\omega\tau au dénominateur, la conductivité devient :

Cette expression ne comporte aucune partie réelle :

La conductivité électrique est donc bien un imaginaire pur dans cette limite.

La puissance volumique instantanée cédée par le champ électrique aux électrons dans le métal est donnée par le terme de transfert de Joule :

En régime sinusoïdal de pulsation \omega, la puissance volumique moyenne dans le temps s'exprime à l'aide des amplitudes complexes par :

Puisque \underline{\sigma} est imaginaire pur, sa partie réelle est nulle (\operatorname{Re}(\underline{\sigma}) = 0). Par conséquent, la puissance volumique moyenne cédée est nulle :

Il en découle immédiatement que la puissance moyenne totale cédée par le champ électrique au métal (par intégration sur le volume de la particule) est nulle :